人类BRAF基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书

【产品名称】

    通用名称：人类BRAF基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）

【包装规格】

    20 测试/盒

【预期用途】

本产品用于体外定性检测黑色素瘤、结直肠癌或甲状腺癌肿瘤患者的石蜡包埋病理组织样本DNA提取物中的BRAF基因V600E体细胞突变（即1799 T>A）。该产品未与具体药物联合进行临床试验，仅针对靶基因突变的检测性能进行了验证。

BRAF基因是人类重要的原癌基因之一，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF(serine/threonine-protein kinase BRAF)，BRAF基因所编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，位于KRAS下游级信号通路上，在细胞生长、分化和凋亡等生物学事件中发挥着重要的调控作用。在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌等均存在不同比例的BRAF突变。BRAF突变主要有两种类型：1.11%位于exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等的点突变；2.89％的突变发生在exon15上的激活区，其中约92％位于第1799核苷酸上，其中1799T>A(V600E)最为常见，大约占V600突变的86%。V600E导致谷氨酸取代缬氨酸而模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，导致BRAF蛋白持续激活，促进细胞增殖和减少细胞凋亡，促进组织侵袭和转移等活动，导致肿瘤的产生。

研究表明，当BRAF基因V600E发生突变的黑色素瘤患者接受威罗菲尼（Vemurafenib）和达拉菲尼（Dabrafenib）等治疗黑色素瘤时，患者可以从中获益，而使用EGFR-TKI药物治疗时，可能无法从中获益，BRAF V600E突变可导致部分K-RAS基因野生型患者对EGFR-TKI药物治疗不敏感；当BRAF基因V600E发生突变的甲状腺癌患者接受Braf V600E突变抑制剂，如威罗菲尼（Vemurafenib）和达拉菲尼（Dabrafenib）等治疗时，患者可以从中受益；当BRAF基因V600E发生突变的结直肠癌患者接受瑞格菲尼（Regorafenib）等治疗时，患者可以从中获益，而用EGFR-TKI药物帕尼单抗（Panitumumab）和西妥昔单抗（Cetuximab）等治疗时，治疗减弱或无效。

具体临床应用时，临床医生须结合实际情况判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊治的唯一依据。

【检验原理】

本试剂盒应用的是ARMS技术，采用ARMS引物配合体系中高特异性热启动Taq酶，可特异性扩增目标突变序列。同时，结合Taqman-MGB探针，在荧光定量PCR仪上通过荧光信号的变化，判断肿瘤组织样本中是否存在BRAF基因突变。

【主要组成成分】

1、主要组成成分

2、不同批号试剂盒中各组分不得互换使用。

3、经验证选择使用QIAGEN DNA提取试剂盒（Cat NO.56404）提取人类基因组DNA。

【储存条件及有效期】

（-20±2）℃条件下避光保存，有效期为9 个月。

应（-20±2）℃冷冻保存，并尽量避免反复冻融，在效期内反复冻融三次，性能稳定。

生产日期及失效日期见包装标签。

【适用仪器】

ABI 7500（探针模式设置，Reporter Dye：FAM、VIC；Quencher Dye：MGB；Passive Reference：NONE。）

【样本要求】

1、所用石蜡包埋病理组织或切片组织一般请选择保存尚未超过3年的样本。

2、确认所取样本组织中含有肿瘤细胞，且组织切片中的肿瘤细胞比例不低于30%。

3、提取的DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA的浓度要求是≥20ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.0之间。提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。

4、采用1×TE缓冲液将样本基因组DNA稀释后上样，并保证每单个反应管添加的DNA量为20ng~30ng。

【检验方法】

在每次PCR反应中，必须对阳性对照组（BRAF阳性质控品）与阴性对照组（BRAF阴性质控品）共同进行检测。

1、扩增试剂准备：室温下解冻反应混合液，涡旋器上混匀10秒，然后快速离心10秒。按每管37μL加入1μL酶液的比例将PCR反应液与酶液混合（总管数为样本数、阳性对照加阴性对照之和，建议每次多算一份的量混合）。以每管38μL的量将上述混合液分装到PCR反应管中，然后将其移至加样区。

2、加样：将待检的DNA样本、BRAF阴性质控品、BRAF阳性质控品依次取2 μL加入PCR反应管中，盖上PCR反应管，快速离心10s后移至扩增区。

3、PCR扩增：打开设置窗口，按照下表中说明的扩增程序进行设置：

信号收集：第二阶段72℃时收集荧光信号，目的基因检测通道为FAM，内参基因检测通道为VIC。

4、检测分析：

a)  基线的确定：软件默认为 3-15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。且以起点与终点之间最好能间隔 8 个循环以上为原则。

b) 阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无典型扩增曲线样本的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。

注意：不同的反应液应分别单独确定各自的基线和阈值后，再进行各自分析。

【阳性判断值或者参考区间】

阴性：FAM通道为“undet”或△Ct>8

阳性：FAM 通道Ct值≤40且△Ct≤8

【检验结果的解释】

1、确认未选择校正荧光参照。需同时选择阳性对照反应孔、阴性对照反应孔和样本反应孔，然后可根据实际情况调节     Threshold至FAM和VIC扩增曲线升起的拐点处，得到目的基因Ct值和内参基因Ct值。

2、ΔCt值的计算方法：ΔCt值=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

3、试剂有效性判断：

      阳性对照：检测结果应为阳性，有明显扩增曲线，扩增曲线有明显指数增长期，且FAM通道Ct值≤35，VIC通道Ct值≤33。若FAM通道有信号，VIC通道偶无信号，亦属正常。

      阴性对照：检测结果应为阴性。

4、样本有效性：待测样本的内控VIC通道应有扩增曲线升起，内参基因的VIC通道Ct值≤40；若内参Ct值＞40，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入浓度不够，需要重新提取DNA后再做或增加DNA用量后重复试验。

5、结果判断：FAM通道 Ct值为“undet”或△Ct>8时，判断为阴性；FAM 通道Ct值≤40且△Ct≤8时，判断为阳性。

注意：样本内参Ct≤40，FAM通道40<Ct≤42且△Ct≤8时，建议重新提取DNA后再做或增加DNA用量后重复试验。

【检验方法的局限性】

1、检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治的唯一依据。

2、样本中肿瘤细胞过少、核酸过度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。

3、肿瘤组织（细胞）可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的检测结果。不合理的样本采集、转运及处理，以及不当的试验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。

4、本试剂盒灵敏度高，在20ng/40μL水平下，低至0.5%的BRAF基因突变可能检出阳性结果，具体临床应用时，对于在接近最低检出限附近的阳性样本，临床医生须结合实际情况判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。

5、检测仅限于说明书规定的样本类型、适用机型及检测方法。

【产品性能指标】

1、试剂盒包装完整，无内容物溢出；标签外观完整，无脱落，标签标识内容清晰；试剂盒内组成正确，无重复、缺失组份的情况。

2、检测试剂盒对应的阴性参考品，检测结果均为阴性，阴性参考品符合率应为100%。

3、检测试剂盒对应的阳性参考品，检测结果均为阳性，阳性参考品符合率应为100%。

4、试剂盒最低检出限可达到：在20ng/40μL水平下能检测出1%的BRAF基因突变。

5、使用试剂盒重复检测精密度参考品10次，检测结果应为阳性，且Ct值的变异系数（CV）≤5%。

6、分析特异性：甲醛、乙醇、NaCl、SDS等微量潜在干扰物对试剂盒的检测结果没有产生明显的干扰现象。

【注意事项】

1、本品仅用于体外诊断，实验前请仔细阅读本说明书。

2、本试剂盒检测结果会受到样本本身的来源、样本采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到DNA提取质量、荧光定量PCR仪型号、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制，可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、准确性的局限性。

3、避免在不必要的情况下冻融试剂盒中的试剂。本试剂盒需低温运输，抵达目的地时应仍处于冷冻状态。

4、因为福尔马林对DNA的交联作用，该类样本中的DNA较易片段化和降解，虽然紫外分光光度计测量的DNA浓度较高，但实际加入反应中的有效DNA量并不够，因此需要相应增加DNA用量。

5、检测所用DNA的质量非常重要，首选新鲜病变组织样本。如果是病理学样本请确定所要提取的组织中含有肿瘤细胞，并推荐使用商业化的DNA提取试剂盒提取DNA，DNA提取后应进行质控确定提取质量，并应尽快进行试验，如不能马上进行试验，所提DNA应立即保存在-20℃以下。

6、本试剂盒所有试剂均经过特别配制，以用于上述检测。随意替换试剂盒中的任何试剂，都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。

7、试剂、阳性质控品、检测样本应作为潜在传染性物质进行处理，遵循国家实验室生物安全防范的相关规定，避免对人员环境的污染。操作人员应规范操作，穿着适当的防护服。避免接触皮肤与眼睛。勿排放到排水沟。

8、应该严格区分质控品和反应试剂的使用，防止污染试剂，造成假阳性。

9、实验时注意防止外源DNA对试剂的污染，注意先加完样本DNA后再进行BRAF阳性质控品的操作。推荐在制备反应试剂和添加DNA模板时，使用单独、专用的移液枪和滤芯枪头。进行反应试剂制备的地点应当与添加模板的地点相隔离。

10、实验完毕用10%次氯酸钠或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器。

11、所有化学药品都具有潜在的危险性。具有PCR实验室上岗证的人员才能使用本试剂盒。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施，严格按照生物制品安全操作规范操作。使用过的试剂盒为临床废弃物，应该妥善处理。

12、PCR实验室应具有3个不同的分区，分别为试剂准备区、样本制备区、扩增区。3个分区应存在压力差，试剂准备间>样本制备间>扩增间。工作人员一旦进入各个工作区域进行工作时，应严格遵守从“试剂准备区→样本制备区→扩增区”的单一流向制度，不得逆入前一工作区。个工作区有专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，各区不得混用。

【标识的解释】无

【参考文献】

1. Chan T L,Zhao W,Leung S Y,et al.B-RAF and K-RAS mutations in colorectal hyperplastic polyps and serrated adenomas.Cancer Res,2003,63(16):4878-81.

2. Dhomen,N.,Marais,R.,New insight into B-raf mutations in cancer.Curr Opin Genet Dev.2007;17(1):31-9

3. Karreth FA, DeNicola GM, Winter SP, Tuveson DA. C-Raf inhibits MAPK activation and transformation by B-Raf(V600E). Mol Cell 2009;36(3):477-86.

【基本信息】

    注册人/生产企业名称：广州市宝创生物技术有限公司

    住所：广州高新技术产业开发区科学城揽月路80号科技创新基地C区第2层204-206、207-211单元、D区第6层615-617单元

联系方式：020-32077730  32077731    

售后服务单位名称：

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生产地址：广州高新技术产业开发区科学城揽月路80号科技创新基地C区第2层204-206、207-211单元、D区第6层615-617单元

生产许可证编号：

【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】

    国械注准20183401029

【说明书核准日期及修改日期】  

    2018年3月12日